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LBA4404农杆菌电转感受态细胞
价格 品牌
面仪 mlBio
  • 产地:上海
  • 货号:ML-G2033
  • 发布日期: 2019-08-29
  • 更新日期: 2022-06-07
产品详请
产地 上海
品牌 mlBio
货号 ML-G2033
用途范围 科研实验
纯度 %
CAS编号
规格 10×50μl 50×50μl
是否进口

LBA4404 Electroporation-Competent Cell说明书


产品货号: ML-G2033                    


保存条件
: -80℃   


产品规格: 
10×50μl  50×50μl


产品介绍

基因型               
Ach5 (rif R) Ti pAL4404 (strepR) Octopine

简要说明

MLBioLBA4404菌株为Ach5型背景,核基因中含有筛选标签——利福平抗性基因rif,为了便于转化操作,此菌株携带一无自身转运功能的章鱼碱型Ti质粒pAL4404,此质粒含有vir基因(vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件,pAL4404质粒自身的T-DNA转移功能被破坏,但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移)。

pAL4404型Ti质粒含有筛选标签:strep,赋予LBA4404菌株链霉素抗性,适用于菸草、番茄、烟草等植物的转基因操作。MLBio开发的LBA4404电转感受态特别适用于大质粒的转化:经pCAMBIA2301质粒(size:11633bp)检测转化效率可达104cfu/μg;经pCAMBIA2301-ZH质粒(size:40kd)检测转化效率可达103cfu/μg。


操作说明

1. 0.2cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟,待其沥干水分,正置5分钟,使乙醇充分挥发,待乙醇挥发干净立即插入冰中,压实冰面,电极杯顶离冰面0.5cm以方便盖上杯盖,冰中静置5分钟充分降温。


2. 取-80℃保存的MLBio农杆菌感受态插入冰中5分钟,待其融化,加入1-5ug质粒DNA(质粒体积不大于6ul,*用试剂盒抽提,双蒸水溶解),用手拨打管底混匀,立即插入冰中,用200ul枪头将感受态-质粒混合物快速移到电击杯中,盖上杯盖,空管保留待用。


3. 启动电转仪,设置参数:C=25uF,PC=200ohm,V=2400V(此参数为MLBio推荐,使用者也可按所用电转仪推荐的protocol操作),将电击杯快速放入电转槽中,电击完成快速插入冰中,加入700ul 无抗生素的LB并转移到感受态空管中,28℃振荡培养2~3小时。


4. 6000rpm离心一分钟收菌,留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的LB或YEB平板上,倒置放于28℃培养箱培养2-3天(当平板只含有50ug/ml kan 时,28℃培养48h即可;平板中同时加入50ug/ml kan,20ug/ml rif 时,需28℃培养60h;如果使用的平板含有50ug/ml rif 则需要28℃培养72-90h)。


注意事项

1. 加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10;质粒不纯或存在乙醇等有机物污染,转化效率急剧下降;质粒增大一倍,转化效率下降一个数量级。


2. 混入质粒时应轻柔操作,转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。


3. 利福平浓度不应高于25 μg/ml,过高的利福平浓度不利于农杆菌生长,会降低其生长速度和转化效率。本公司感受态计算转化效率时所用平板只含有50 μg/ml kan,若所用平板同时含有20 μg/ml rif则转化效率降低到1/2。


4. 培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌;根据所用菌株抗性加入链霉素或庆大霉素可防止Ti质粒丢失,但链霉素不利于农杆菌的转基因操作,所以一般培养农杆菌时不考虑链霉素或庆大霉素,Ti质粒丢失的概率极低 (可以忽略)。


备      注

1、农杆菌相关抗生素配方:

抗生素

配方

原液浓度

工作浓度

羧苄青霉素 (carb)

双蒸水溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌

50 mg/m

50 μg/ml

硫酸卡那霉素 (kan)

双蒸水溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌

50 mg/ml

50 μg/ml

链霉素 (strep)

双蒸水溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌

10 mg/ml

50 μg/ml

利福平 (rif)

DMSO溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌

10 mg/ml

20 μg/ml

庆大霉素 (gent)

双蒸水溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌

20 mg/ml

40 μg/ml


2、常用农杆菌抗性: (R:抗;S:敏感。)

羧苄青霉素(carb)

链霉素(strep)

利福平(rif)

庆大霉素(gent)

硫酸卡那霉素(kan)

R

R

R

S

S

S

R

R

S

R

S

R

R

S

S

S

R

R

S

S

S

R

R

R

S


3、LB及YEB配方:

component

LB(液体)/L

LB(固体)/L

component

YEB(液体)/L

YEB(固体)/L

Yeast extract

5 g

5 g

Yeast extract

1 g

1 g

NaCl

10 g

10 g

牛肉浸膏

5 g

5 g

NaOH

PH7.0

PH7.0

蔗糖

5 g

5 g

Agar

15 g

MgSO4*7H2O

0.49 g

0.49 g




NaOH

PH7.0

PH7.0




Agar

15 g


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